RESUMEN

La inactivación viral por medio de agentes químicos representa una medida sanitaria eficaz contra la propagación del patógeno. En este estudio se determinó la eficacia de los desinfectantes de Centrovet en la neutralización del virus ISA, a través de un ensayo de neutralización viral en cultivo celular, utilizando condiciones de concentración de los productos y tiempos de exposición similares a las observadas en terreno. La presencia del virus tratado con los productos se determinó por medio de IFAT, presencia de efecto citopático, y RT-PCR específico.
Nuestros resultados muestran que todos los desinfectantes evaluados son eficaces en neutralizar o eliminar al virus ISA, en al menos cinco logaritmos, concluyendo que los desinfectantes, en las condiciones controladas, son capaces de eliminar el 99,999% del virus.

INTRODUCCIÓN

La Anemia Infecciosa del Salmón es una grave enfermedad causada por el virus ISA, ortomixovirus aislado por primera vez en 1984, en Noruega. El virus es altamente patógeno, que afecta principalmente al Salmón del Atlántico (Salmo salar), y cuyo ciclo de vida se caracteriza por alojarse y replicarse en el tejido endotelial de su hospedero, donde se origina una severa hemorragia generalizada, que termina en una falla multisistémica acompañada de un fuerte cuadro anémico. Su virulencia es variable, aunque se ha reportado que el virus es capaz de eliminar hasta el 100% de los peces infectados.
Desde su primer brote en Chile en Julio de 2007, el virus ha  generado pérdidas estimadas en varias decenas de millones de dólares. Debido a todo lo anterior, la disponibilidad de herramientas efectivas para el control y prevención de la infección y propagación de virus se ha transformado en una primera necesidad para la industria salmonera y el país.
Parte de esta necesidad consiste en la disponibilidad de agentes desinfectantes eficaces en la neutralización viral.
El uso de desinfectantes como mecanismo de neutralización viral se ha utilizado contra una serie de patógenos en la industria acuícola. Particularmente, el estudio de diversos agentes en contra del virus ISA ha sido estudiado y reportado, demostrándose diversos grados de eficacia contra el virus utilizando Iodóforos, Cloramina T, y mezclas de Ácido peracético, Peróxido de hidrógeno y Ácido acético (Smail et al., 2004). Otros desinfectantes, como Amonios cuaternarios,  Glutaraldehído e Hipoclorito de Sodio han sido también evaluados, con eficacia demostrada en condiciones de laboratorio. En términos de agentes desinfectantes, es generalmente aceptado que la resistencia de virus envueltos, como ISA es baja, y muy inferior a la presentada por otros virus, de cápside proteica, como el virus IPN.
En el presente estudio, se muestran los resultados de neutralización de ISAv de seis productos actualmente fabricados por Laboratorio Centrovet. Estos estudios descansan en las medidas implementadas por nuestro país y otros previamente afectados por este virus, consistente principalmente en evitar la propagación desde los centros afectados, y realizar una desinfección de la totalidad de las estructuras involucradas en el proceso productivo.
Los resultados expanden y complementan los hallazgos previamente entregados por nuestro laboratorio, demostrando la efectividad de estos productos en anular la capacidad del virus de infectar y replicarse en células susceptibles.

OBJETIVO
Determinar la actividad neutralizante o viricida de 6 productos actualmente comercializados por Laboratorio Centrovet en contra del virus ISA, en un modelo de infección in vitro.

METODOLOGÍA
Virus y línea celular. Se utilizó un aislado de ISAv Chileno, obtenido desde macerados de riñón anterior de Salmo salar con mortalidad atribuida a ISA. La identificación viral se realizó por medio de PCR específico. Para los ensayos de cultivo celular, se utilizó la línea celular derivada de riñón anterior de salmón-1 (SHK-1), Salmon Head Kidney-1 (Dannevik et al., 1997).

Titulación viral. Se realizó titulación de ISAv en forma previa y posterior a la infección mediante la técnica de Reed y Muench (Reed and Muench, 1938), determinándose el título viral del sobrenadante del cultivo mediante la TCID50 (Dosis Infectiva de Cultivo Tisular 50).

Ensayo de inactivación viral. Muestras de concentración viral conocida se trataron con los diferentes desinfectantes diluidos en agua de mar, a fin de simular las condiciones naturales de contacto viral. El contacto de los desinfectantes con el virus no superó los 30 segundos. Posterior a este tiempo, el desinfectante fue removido mediante diálisis y el dializado se utilizó para infectar células SHK-1. Como control positivo de detección viral se incubó el virus con agua de mar, y como control negativo se utilizó sólo el vehículo de dilución. Los desinfectantes evaluados y la concentración utilizada se muestran en la tabla 1.

Tabla 1. Tipos de desinfectantes y dilución evaluada en ensayo de neutralización.

Evaluación de efecto citopático. Los inóculos virales pretratados con desinfectantes se utilizaron para infectar microplacas de 24 pocillos en diluciones seriadas logarítmicas (base 10) en células SHK-1 mantenidas en medio de cultivo L-15. Se evaluó la presencia de efecto citopático hasta 28 días posterior a la infección viral.

Detección de virus en cultivos infectados. La presencia de infección viral se evaluó por inmunofluorescencia indirecta por microscopía confocal (IFAT), utilizando anticuerpos monoclonales específicos contra el virus. Adicionalmente, se evaluó la presencia del virus mediante RT-PCR, utilizando los partidores recomendados por la OIE contra el segmento 6, Seg6U/Seg6L (OIE Diagnostic Manual for Aquatic Animal Diseases. 2006).

RESULTADOS

El virus tratado con los desinfectantes de Centrovet es incapaz de generar partículas virales al interior de células en cultivo.
Como primera aproximación para determinar la efectividad de los tratamientos, se evaluó la presencia de virus en células infectadas con los virus pretratados utilizando inmunofluorescencia con un anticuerpo monoclonal específico contra la hemaglutinina viral (Figura 1A). La presencia de fluorescencia en cultivo celular significa una reacción positiva del anticuerpo y por lo tanto una incapacidad del desinfectante utilizado en neutralizar el virus previo a la infección. Los resultados se muestran en la figura 1B, que muestra que en ninguno de los tratamientos realizados es posible visualizar partículas virales, sugiriendo la efectividad de los productos evaluados en la neutralización viral. Apoyando estos resultados, en ningún grupo de células infectadas con los virus pretratados con los desinfectantes fue posible evidenciar efecto citopático, bajo ninguna de las diluciones evaluadas, hasta 28 días posterior a la infección (Tabla 2).

Figura 1. A. Inmunofluorescencia específica contra la hemaglutinina del virus ISA en células infectadas (izquierda) y control (derecha). B. Resultados del análisis anterior en células infectadas con inoculo viral pretratado con los desinfectantes señalados en la figura.

Tabla 2. Presencia de efecto citopático reportado en células SHK con inóculos virales pretratados.

La ausencia de partículas virales se correlaciona con la ausencia de replicación viral.
A pesar que los resultados anteriores son sugerentes de una activa neutralización viral por parte de los agentes evaluados, estudios previos han reportado que la ausencia de detección de ISAv tanto en cultivo celular como por IFAT puede no significar ausencia de virus (Gustafson y cols., 2008). Aún más, estudios in vivo demuestran que existen status de infección viral subletal y asintomáticas que puede no ser detectada por los métodos anteriores (Giray y cols., 2005). Como alternativa, se ha planteado el RT-PCR como una metodología más sensible y robusta, que permite un mejor diagnóstico cuando el virus mantiene una baja tasa replicativa (Gustafson y cols., 2008).
Para determinar la presencia de ISAv por RT-PCR se utilizaron partidores que amplifican el segmento 6, codificante para la proteína hemaglutinina. Estos partidores son los aceptados por la OIE como método de diagnóstico para ISAv, y amplifican un segmento de 130 pares de bases (Figura 2).
Se realizaron extracciones de RNA a cultivos virales incubados en las mismas condiciones anteriores, y posteriormente se procesaron para RT-PCR. Los resultados profundizan lo observado anteriormente y demuestran la eficacia de los desinfectantes, puesto que en ninguno de los tratamientos fue posible identificar el producto correspondiente a la amplificación del segmento 6 de ISAv (Figura 2).

Figura 2. Resultados de RT-PCR específico de cultivos celulares de células SHK-1 infectados con virus ISA, tratados previamente tratados con los agentes indicados. La flecha muestra la banda de 130 pares de bases correspondiente al producto específico del gen de la hemaglutinina de ISAv.

El virus tratado con los desinfectantes de Centrovet disminuye su título en al menos 5 logaritmos.
La ausencia de producto PCR específico del virus en todos los tratamientos sugiere que el virus disminuye su título infectivo severamente. Para determinar la magnitud de esta disminución, se realizaron análisis de titulación del virus previo y posterior a la incubación con los desinfectantes, por medio de la técnica de Reed y Muench. Los resultados muestran que el virus permanece indetectable en todos los tratamientos, demostrando que al menos, en las condiciones ensayadas, el título viral disminuye hasta ser indetectable. Debido a que el inoculo viral poseía un título de 5,2 TCID50/ml, es posible aseverar que los desinfectantes utilizados disminuyen el título viral de ISAv en al menos cinco logaritmos (Tabla 3).

Tabla 3. Recuento de título viral (log10) antes y después del tratamiento.

*N.D. No Detectado

DISCUSION

El objetivo del presente estudio fue el evaluar la capacidad de diferentes productos desinfectantes de neutralizar o eliminar cosechas virales del ISA. Para esto, se incubaron muestras de virus con los diferentes productos por un tiempo de incubación mínimo, con el fin de imitar condiciones de terreno, donde la mayoría de los productos evaluados presentan un tiempo de contacto mínimo con las posibles fuentes de virus; como por ejemplo durante el paso de personal por pediluvios en pisciculturas y centros de engorda. Con estos fines se removió el desinfectante a no más de 30 segundos posterior al contacto con el virus. Por otro lado, la ausencia de remoción del producto puede generar actividad antiviral acumulativa debida a la persistencia y no a un efecto instantáneo, alterando la interpretación de los resultados.
Las muestras virales incubadas con los desinfectantes se dializaron y se evaluó la presencia de partículas virales activas por diferentes metodologías.
Primeramente se determinó la presencia de virus por inmunofluorescencia, técnica que permite no sólo evaluar la presencia del virus, sino que también demostrar que las partículas virales son capaces de infectar células susceptibles y generar nuevas partículas virales. Los resultados mostraron que todos los desinfectantes evaluados impidieron la detección del virus por esta técnica, fenómeno consistente con la ausencia de efecto citopático en los cultivos virales (Figura 1 y Tabla 2).
A fin de determinar si es posible detectar virus de una forma más sensible y específica, se realizó una detección molecular del RNA mensajero viral, por medio de la técnica de RT-PCR, utilizando partidores específicos para el gen de la hemaglutinina del virus. Si bien esta técnica es menos sensible que otras técnicas como el qPCR, los resultados entregados son bastante confiables referente a la presencia del virus, es decir, representan una visión cualitativa del status de infección viral. Nuevamente, los resultados muestran ausencia de detección viral en todas las muestras pretratadas con desinfectantes, confirmando los hallazgos anteriores y sugiriendo que la inactivación del virus es total.
Finalmente, debido a que el inoculo viral utilizado en las infecciones presentaba un título de 105,2 TCID50/ml, es posible aseverar que los desinfectantes, en las condiciones evaluadas, son capaces de eliminar al menos cinco logaritmos virales, siendo entonces efectivos en la eliminación de 99.999% del virus, en menos de 30 segundos.

Reed L and Muench HA. A simple method of estimating fifty percent end points. Amer. J. Hyg. 27: 493-497. 1838.

Dannevik BH, Brudseth BE, Gjøen T, Rode N, Wergeland HI Evensen Ø, and Press MC. Characterization of a long-term cell line (SHK-1) developed from the head kidney of Atlantic salmon (Salmo salar L.). Fish & Shellfish Immunol. 7: 213-226. 1997.

Smail DA, Grant R, Simpson D, Bain N and Hastings TS. Disinfectants against cultured Infectious Salmon Anaemia (ISA) virus: the virucidal effect of three iodophors, chloramine T, chlorine dioxide and peracetic acid/hydrogen peroxide/acetic acid mixture. Aquaculture 240: 29-38. 2004.

Gustafson L., Ellis S, Bouchard D, Robinson T, Marenghi F , Warg J and Giray C. Estimating diagnostic test accuracy for infectious salmon anaemia virus in Maine, USA. J. Fish Dis. 31: 117-125. 2008.

Giray C., Opitz HM, Maclean S, and Bouchard D. Comparison of lethal versus non-lethal sample sources for the detection of infectious salmon anemia virus (ISAV). Dis. Aquat. Org. 66: 181-185. 2005.